Immobilisierung von α | Langfang-Handmarkengruppe

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12708 (2023) Diesen Artikel zitieren

827 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

In dieser Studie erfolgte die Herstellung von Isomaltooligosaccharid aus Kartoffelschalenstärke in drei Schritten: Verflüssigung, Verzuckerung und Transglucosylierung. Darüber hinaus Klonierung des α-Transglucosidase-Gens aus Aspergillus niger (GH31-Familie), Transformation in E. coli BL21 (DE3), Überexpression und Reinigung des resultierenden Proteins für die Produktion von α-Transglucosidase. Die erzeugte α-Transglucosidase wurde dann mit magnetischen Nanopartikeln gebunden, was die Wiederverwendbarkeit auf bis zu 5 Zyklen mit mehr als 60 % Aktivität verbesserte. Alle Modifikationen wurden mithilfe der folgenden Methoden charakterisiert: Fourier-Transformations-Infrarotanalyse, Transmissionselektronenmikroskopie, Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie, energiedispersive Röntgenspektroskopie, Röntgenbeugungsspektroskopie, thermogravimetrische Analyse und dynamische Lichtstreuung (DLS). Analyse. Darüber hinaus wurden die optimalen Bedingungen für die Transglucosylierung durch RSM wie folgt bestimmt: Enzym-zu-Substrat-Verhältnis 6,9 U g−1, Reaktionszeit 9 h, Temperatur 45 °C und pH 5,5 mit einer Ausbeute von 70 gl−1 (± 2,1). ). Die MALDI-TOF-MS-Analyse zeigte einen DP der IMOs im Bereich von 2–10. Die detaillierte strukturelle Charakterisierung von Isomaltooligosaccharid durch GC-MS und NMR deutete auf die α-(1 → 4)- und α-(1 → 6)-D-Glcp-Reste als Hauptbestandteile sowie kleinere α-(1 → 2)- und α- (1 → 3) -D-Glcp-Reste.

Isomaltooligosaccharide (IMOs) sind unverdauliche, aber fermentierbare Oligosaccharide, die das Wachstum bestimmter gesundheitsfördernder Bakterien, insbesondere Bifidobakterien und Laktobazillen, steigern, die den Darmstoffwechsel beeinflussen und einen Einfluss auf die mikrobielle Ökologie des Magen-Darm-Trakts haben1,2,3,4,5,6. IMOs sind präbiotische Oligosaccharide, die aus Glucoseeinheiten bestehen, die hauptsächlich durch α-(1 → 6) und α-(1 → 4) glykosidische Bindung mit einem geringeren Anteil an α-(1 → 3) (Nigerose) und α-(1 → 2) verbunden sind ) (kojibiose) glykosidische Bindung7,8,9. Typischerweise weisen IMOs unterschiedliche Polymerisationsgrade (DP) auf, zu denen Isomaltose (DP2), Isomaltotriose (DP3), Isopanose, Panose (DP3), Isomaltotetrose (DP4) und Isomaltopentose (DP5) gehören10,11. Die IMOs werden nicht von menschlichen Enzymen verdaut, sondern von der Darmflora fermentiert, was ihre präbiotische Wirkung entfaltet5,12,13. Zusätzlich zur präbiotischen Wirkung haben IMOs einen niedrigen glykämischen Index und wirken als kalorienarmer Süßstoff, der Diabetikern gesundheitliche Vorteile bietet10,14.

Kommerziell werden IMOs aus Stärke verschiedener Quellen (Süßkartoffel, Kartoffel, Tapioka, Reis und Banane) hergestellt11,15,16,17,18. Im Allgemeinen bestand die traditionelle Methode zur Herstellung von IMOs aus drei Schritten: Verflüssigung, Verzuckerung und Transglucosylierung6,19. Aktuelle Studien haben die gleichzeitige Verzuckerung und Transglukosylierung (SST) für die Produktion von IMOs16,20 gezeigt. Diese Studien verbesserten die Effizienz der IMO-Produktion und verkürzten die Reaktionszeit. Verschiedene Studien haben auch über die enzymatische Produktion von IMOs aus Saccharose unter Verwendung von Dextransucrase und Dextranase berichtet21,22,23. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Entwicklung magnetischer Nanopartikel (MNPs) zur Immobilisierung von α-Transglucosidase eine beste Möglichkeit ist, die Wiederverwendbarkeit des Enzyms zu verbessern24,25,26.

In dieser Studie wurde zunächst die Extraktion von Stärke aus Kartoffelschalen und anschließend die Verflüssigung und Verzuckerung der verflüssigten Stärke durchgeführt. Ein Gen, das für α-Transglucosidase (durchschnittliches MW ~ 110 kDa) aus Aspergillus niger (GH31-Familie) kodiert, wurde von GenScript (Singapur) synthetisiert und in den pET28a-Vektor kloniert. Angesichts der Bedeutung von Enzymen für die IMO-Produktion wurde versucht, BL21(DE3) heterolog in E. coli zu exprimieren. Darüber hinaus wurde die Transglucosylierungsreaktion durch RSM optimiert, um die Ausbeute an IMOs zu maximieren. Anschließend wurde die produzierte α-Transglucosidase mit MNPs immobilisiert und durch verschiedene Analysetechniken charakterisiert. Abschließend wurden die Strukturmerkmale der gereinigten IMO-Fraktion mithilfe von MALDI-TOF-MS, GC-MS und NMR analysiert.

Kartoffelschalenabfälle wurden in der Institutsmesse (NABI Mohali, Punjab, Indien) gesammelt und zur Stärkegewinnung verwendet. Alle bei der IMO-Charakterisierung verwendeten Chemikalien und zwei Enzyme, Termamyl® SC DS (A4862) und Fungamyl® (A8220), die für die Verflüssigungs- und Verzuckerungsreaktion verwendet werden, wurden von Sigma-Aldrich gekauft. Die α-Transglucosidase-Gensequenz von Aspergillus niger (GH31-Familie) wurde von GenScript Biotech Corporation synthetisiert und in den pET28a-Vektor kloniert. Die Standards Glucose, Maltose, Maltotriose, Isomaltose, Isomaltotriose, Panose, Isopanose und alle anderen in der vorliegenden Studie verwendeten Chemikalien wurden ebenfalls von Sigma-Aldrich bezogen.

Kartoffelschalen (100 g) wurden zunächst gewaschen und dann mit einem Mixer im Labormaßstab gemischt. Sofort wurde die gemischte Mischung filtriert und der verbleibende Rückstand zwei- bis dreimal mit entionisiertem Wasser (5 × 200 ml) gespült. Das Filtrat wurde in einem Becherglas gesammelt und bei 4 °C aufbewahrt, damit sich die Stärke absetzen konnte. Der Überstand wurde verworfen und die weiße Stärkeschicht aus dem Becherglas in einem Ofenblech gesammelt und 24 Stunden lang in einem Heißlufttrockner bei 37 °C trocknen gelassen. Anschließend wurden die getrockneten Rückstände zu feinem Pulver gemahlen und zur späteren Verwendung in einem luftdichten Behälter aufbewahrt27,28.

Extrahierte Stärke wurde zu Wasser gegeben und eine Aufschlämmung hergestellt (1 g 10 ml-1). Der pH-Wert der Aufschlämmung wurde mit Milchsäure auf 6,9 eingestellt. Es wurden verschiedene Verhältnisse eines Enzyms (Termamyl® SC DS) zu Substrat (Stärke) verwendet, beispielsweise 0,3–5,5 U g-1. Der Mischer wurde 1 Stunde lang auf 95 °C eingestellt. Die Reststärke wurde mit dem Jodtest (KI/I2)29 geschätzt.

Die Stärkeaufschlämmung (1 g x 10 ml) wurde auf verschiedene pH-Werte (4–8) eingestellt. Die Aufschlämmung wurde mit einem festen Verhältnis von Enzym (Termamyl® SC DS) zu Substrat (0,7 U g-1) bei einer festen Temperatur von 95 °C 1 Stunde lang verflüssigt. Die Reststärke wurde wie oben erwähnt geschätzt.

Zunächst wurde 1 g/10 ml-1 Stärke mit einem festen Enzym (Termamyl® SC DS) zu Substratverhältnis (0,7 U g-1) und pH-Wert (6,9) bei verschiedenen Temperaturen (65–110 °C) 1 Stunde lang hydrolysiert ,30,31.

Die verflüssigte Aufschlämmung wurde mit einem anderen Verhältnis von Enzym (Fungamyl®) zu Substrat (0,7–9,6 U g-1) weiter verzuckert, was sich auf die Ausbeute an Maltooligosaccharid auswirkte. Die anderen drei Faktoren (Temperatur, pH-Wert und Zeit) wurden auf 50 °C, pH 5,5 bzw. 12 Stunden eingestellt. Nach 12 Stunden wurde die Reaktion gestoppt und DC und HPAEC-PAD wurden zur Analyse der Reaktionsmischung verwendet6,30,31.

Der Effekt unterschiedlicher Reaktionszeiten (2–12 h) beeinflusste auch die Ausbeute an Maltooligosaccharid, wenn die anderen drei Faktoren (Enzym-zu-Substrat-Verhältnis, Temperatur und pH-Wert) auf 1,2 U g-1, 50 °C und pH 5,5 festgelegt wurden , jeweils. Alle Reaktionen wurden gestoppt und wie oben erwähnt analysiert.

Die verflüssigte Aufschlämmung wurde mit einem festen Enzym-zu-Substrat-Verhältnis (1,2 U g-1) und einem pH-Wert von 5,5 bei verschiedenen Temperaturen (40–70 °C) 4 Stunden lang verzuckert. Nach 4 Stunden wurde die Reaktion gestoppt und wie oben beschrieben analysiert.

Die Reaktionsmischung variierte bei unterschiedlichen pH-Werten (4,5–7,5) und beeinflusste die Maltooligosaccharid-Ausbeute, wenn die anderen drei Faktoren (Enzym-zu-Substrat-Verhältnis, Temperatur und Zeit) auf 1,2 U g-1, 50 °C bzw. 4 Stunden eingestellt wurden . Nach 4 Stunden wurde die Reaktionsmischung durch 10-minütiges Sieden der Mischung gestoppt und die Reaktionsmischung wurde wie oben erwähnt analysiert.

Das synthetisierte α-Transglucosidase-Gen wurde in pET-28a kloniert und in E. coli BL21(DE3) transformiert. Das Enzym wurde mit IPTG (0,2 mM) über Nacht bei 18 °C in 1 l Terrific-Brühe induziert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation (7000 U/min, 10 min) geerntet und durch Ultraschallbehandlung in Puffer A (10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure [HEPES]) lysiert und die Zellen in einem geeigneten Puffer resuspendiert mit Proteaseinhibitoren sowie durch Ultraschall lysiert. Anschließend wurde der Überstand gesammelt, das Enzym durch eine Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)-Reinigungssäule gereinigt und das Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt32.

Zur Reinigung des α-Transglucosidase-Proteins wurde eine HisTrap HP-Säule (GE Healthcare) verwendet. N'-terminales His6-markiertes rekombinantes α-Transglucosidase-Protein wurde auf eine Säule gegeben, die bereits mit Puffer A (10 mM HEPES mit pH 7,5, 250 mM NaCl) voräquilibriert worden war. Puffer B (10 mM HEPES mit pH 7,5, 250 mM NaCl und 500 mM Imidazol) wurde verwendet, um gebundene Proteine in einem Schritt nach dem Waschen mit Puffer A zu eluieren. Weiteres α-Transglucosidase-Protein wurde mit Amicon Ultra-15 100 kDa gereinigt und konzentriert Molekulargewichts-Cut-Off-Konzentrator. Die gereinigte α-Transglucosidase wurde dann zur weiteren Verwendung bei –80 °C aufbewahrt32.

Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie wurde verwendet, um die sekundären Strukturveränderungen im freien Enzym nach der Immobilisierung zu überwachen. Zur Aufzeichnung der UV-CD-Spektren im Wellenlängenbereich von 190–280 nm wurde ein biologisches Spektrometer MOS-500 verwendet. Die Enzymkonzentration von 0,2 mg/ml wurde in allen CD-Messexperimenten bei 6 °C in einem verdünnten Puffer (Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4) eingesetzt. Das Tertiärstrukturmodell der α-Transglucosidase wurde in Phyre 2 erstellt und in der PyMOL-Software verarbeitet33. Es wurde einer α-Transglucosylase (Proteindatenbank-ID: 4B9Z) überlagert, um kritische Reste zu identifizieren34.

Die verzuckerte Aufschlämmung wurde weiter mit einem Verhältnis von 0,7–11 U g-1 Enzym (α-Transglucosidase) zu Substrat (verzuckerte Stärke) bei drei festen Faktoren behandelt: Temperatur, pH-Wert und Zeit: 45 °C, 5,5 und 12 Stunden. jeweils. Das Produkt wurde durch TLC und gepulste amperometrische Detektion mit Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie (HPAEC-PAD)1,2,3,4,5,6 analysiert.

Die verzuckerte Stärke wurde mit einem Verhältnis von 5,6 U g-1 Enzym (α-Transglucosidase) zu Substrat (verzuckerte Stärke) bei 45 °C und pH 5,5 inkubiert. Zur Zeitoptimierung wurden in unterschiedlichen Zeitintervallen (2–12 Stunden) Proben entnommen. Das Produkt wurde wie oben erwähnt analysiert.

Der Einfluss des pH-Werts auf die IMO-Ausbeute variierte zwischen 3,5 und 7,5, wenn das Enzym-Substrat-Verhältnis, die Temperatur und die Zeit jeweils 6 Stunden lang in einem schüttelnden Wasserbad auf 5,6 U g-1 und 45 °C eingestellt wurden. Nach 6 Stunden wurde die Reaktion gestoppt und das Produkt mittels TLC und HPAEC-PAD analysiert.

Die verzuckerte Stärke wurde einer anderen Temperatur zwischen 35 und 75 °C ausgesetzt und das Enzym-zu-Substrat-Verhältnis, der pH-Wert und die Zeit wurden für 6 Stunden auf 5,6 U g-1 bzw. 5,5 pH eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde wie oben erwähnt analysiert.

Der Box-Behnken wurde verwendet, um die besten Bedingungen für die Transglucosylierungsreaktion zu optimieren. Die in dieser Studie untersuchten Faktoren waren das Enzym-zu-Substrat-Verhältnis (A), der pH-Wert der Aufschlämmung (B), die Temperatur (°C) und die Reaktionszeit (h). Die drei Faktoren wurden mit + 1, 0 und – 1 für hohe, mittlere und niedrige Werte bewertet. Der Entwurf enthält insgesamt 29 Läufe basierend auf Box-Behnken35.

Die magnetischen Nanopartikel (Fe3O4) wurden durch Kopräzipitation von Eisen- und Eisenchlorid in Gegenwart von 1,5 M NaOH als Reduktionsmittel synthetisiert. Zur Herstellung magnetischer Nanopartikel wurden 5,4 g FeCl3.6H2O in 25 ml 0,4 M HCl mit 2 g FeCl2.4H2O gelöst und die Reaktionsmischung auf 200 °C erhitzt, bis eine gelbe, transparente Lösung entstand. Darüber hinaus wurde die gelbe transparente Lösung tropfenweise zu einer 1,5 M NaOH-Lösung bei 80 °C gegeben. Als die gelbe Lösung zur NaOH-Lösung gegeben wurde, bildete sich ein schwarzer Niederschlag von Fe3O4. Der Niederschlag wurde in einem Magnetständer gesammelt und mit MQ-Wasser gewaschen. Der Niederschlag wurde zur weiteren Verwendung in 200 ml 0,1 M Tetramethylammoniumhydroxid (TMAOH)-Lösung aufbewahrt24,26.

Das synthetisierte Fe3O4 wurde durch eine Silica-Beschichtung stabilisiert, die auch die Bildung von Agglomerationen aufgrund der Wechselwirkung zwischen den Partikeln verhinderte. Mit TMAOH gelagerter Magnetit wurde in einen Falcon-Magnetständer gegeben und der Überstand wurde verworfen. Magnetit wurde mit einem Volumenverhältnis von 1:1,4 Ethanol und 10 % Tetraethylorthosilikat (TEOS) in das Becherglas überführt. Die Mischung wurde zur Synthese von mit Siliciumdioxid beschichteten Nanopartikeln 6 Stunden lang auf 90 °C erhitzt und anschließend gewaschen und gelagert24,26.

Die erhaltenen Silica-beschichteten Magnetit-Nanopartikel wurden mit einem 16-PHDA-Linker im Verhältnis 1:1 verknüpft. Die Mischung wurde 30 Minuten lang in ein Ultraschallgerät gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Lösung mit Wasser gespült und für die zukünftige Verwendung aufbewahrt24,26.

Um α-Transglucosidase mit den Carboxylgruppen von 16-PHDA zu koppeln, wurde die Mischung zunächst mit EDC in 0,1 M MES-Puffer aktiviert, dann wurde α-Transglucosidase in der gleichen Menge zugegeben und die Mischung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen h24. Die Bradford-Methode wurde verwendet, um die Menge des auf Nanopartikeln immobilisierten Enzyms in Bezug auf den Proteingehalt zu berechnen. Zur Bestimmung des Enzymbeladungsprozentsatzes wurde die folgende Gleichung verwendet:

Ei = Et–Es, Ei = Immobilisiertes Enzym, Et = Anfangsmenge des zugesetzten Enzyms, Es = Enzymmenge im Überstand.

Agilent Cary, 660-Serie mit DTGS-Detektor-Spektrophotometer, wurde zur Aufnahme der IR-Spektren der Proben bei Frequenzen zwischen 400 und 4000 cm−1 26 verwendet. Transmissionselektronenmikroskopie mit hoher Auflösung (HR-TEM, LIBRA 120), 300 kV verwendet für die Größe und Form von Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16 PHDA und Fe3O4@SiO2-16 PHDA-α-Transglucosidase. Die Größe und Oberflächenmorphologie von Fe3O4 und Fe3O4@SiO2 wurden mittels Rastermikroskopie (FE-SEM, Thermoscientific Apreo S)24,26 untersucht. Mithilfe eines Röntgendiffraktometers (XRD; Rigaku, Smart LAB SE) wurden die Reinheit und Kristallinität von Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16 PHDA und Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-Transglucosidase gemessen26, 36. Darüber hinaus wurde der prozentuale Gewichtsverlust der Proben mithilfe der thermogravimetrischen Analyse (TGA) (Netzsch Simultan-Thermoanalysator STA 449F1) bei Temperaturen im Bereich von 25 bis 800 °C in einer Stickstoffatmosphäre (N2) analysiert. Schließlich wurden das Zetapotential und die kolloidale Stabilität mithilfe der dynamischen Lichtstreuungsanalyse (DLS)24,26 gemessen.

Um die Stabilität von freier und immobilisierter α-Transglucosidase bei verschiedenen pH- und Temperaturbedingungen zu bestimmen, wurden die Maltooligosaccharide mit α-Transglucosidase bei pH-Werten im Bereich von 3,5 bis 8,5 bzw. Temperaturen (30–80 °C) inkubiert. Schließlich stellt die prozentuale relative Aktivität in jedem Experiment die Enzymaktivität relativ zur Kontrolle dar, die mit 100 % angenommen wurde37,38.

Die Wiederverwendbarkeit der immobilisierten α-Transglucosidase wurde durch Hydrolyse von Maltose unter optimierten Bedingungen (Enzym-zu-Substrat-Verhältnis 6,9 U g-1, Reaktionszeit 9 h, Temperatur 45 °C und pH 5,5) analysiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde die immobilisierte α-Transglucosidase am Ende jedes Zyklus durch einen Magnetständer gewonnen, zwei- bis dreimal gründlich mit entionisiertem Wasser gereinigt und dann für den nachfolgenden Reaktionszyklus verwendet. Die gewonnene immobilisierte α-Transglucosidase wurde in der frischen Maltoselösung wiederverwendet. Als Kontrolle galt der erste Zyklus der Aktivität des immobilisierten Enzyms mit 100 % Aktivität24.

Die optimierten Testbedingungen wurden verwendet, um die kinetischen Parameter der freien und immobilisierten α-Transglucosidase zu ermitteln, mit der Ausnahme, dass die Maltosekonzentration von 100 auf 500 mM geändert wurde. Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Diagramme wurden zur Berechnung der kinetischen Parameter verwendet, einschließlich der Michaelis-Menten-Konstante (Km), der Umsatzzahl (Kcat) und der katalytischen Effizienz (Kcat/Km)39.

Die rohen IMOs wurden mit HPLC-RI auf einer Superdex-Peptid-10/300-Säule (10 × 300–310 mm) gereinigt. Die Probe wurde bei 40 °C in den Chromatographieschrank gegeben. Der Autosampler wurde verwendet, um die Probe (15 µl) in die Säule zu injizieren. Die Probe wurde mit einer Flussrate von 0,5 ml/min mit entionisiertem destilliertem Wasser eluiert und der Ausfluss manuell gesammelt. Darüber hinaus wurde die gereinigte Probe durch TLC, HPAEC-PAD, MALDI-TOF-MS, GC-MC und NMR40 charakterisiert.

IMOs-Proben (5 mg ml-1) wurden in einem Abstand von 1 cm vom Boden auf TLC-Kieselgel-Glasplatten (60 F 254, 10 × 20 cm; TLC-Kieselgel, Sigma Aldrich) getupft. Nach dem Tüpfeln ließ man die Proben trocknen. Der untere Teil der Platte wurde in die mobile Phase (n-Propanol/Wasser/Ethanol in 70:20:10 v/v/v) eingetaucht. Die Probenflecken wanderten mit der mobilen Phase nach oben. Die Platten wurden getrocknet, als die mobile Phase das zweite Ende der Platte erreichte. Die Sprühlösung (5 g L-1α-Naphthol und 50 ml L-1 H2SO4) wurde auf die TLC-Platten aufgetragen. Die Platten wurden 10 Minuten lang auf 120 °C erhitzt18.

Das MALDI-TOF-MS (AB SCIEX 5800) wurde verwendet, um das Massenspektrum der gereinigten IMO-Probe aufzuzeichnen. Ein äquivalentes Volumen Matrixlösung (0,1 M 2,5-Dihydroxybenzoesäure und 0,03 M 1-Hydroxyisochinolin in wässriger Lösung mit 50 Prozent ACN) wurde mit einer wässrigen Probe gemischt. Die Probenmischung wurde auf eine MALDI-Targetplatte geladen und getrocknet41. Mithilfe der Spektren von 200 Laserpulsen42 wurde ein Massenspektrum erstellt.

Um die Glykosylbindungszusammensetzung von IMOs zu untersuchen, wurden teilweise methylierte Alditolacetat-Derivate hergestellt. Die IMOs-Proben (5 mg) und 15 mg NaOH-Pulver wurden in trockenes DMSO gegeben. Jede Probe erhielt 1 ml Jodmethan und die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gemischt. Ein Stickstoffstrom wurde verwendet, um überschüssiges Iodmethan zu entfernen, und die Proben wurden in zwei Schichten aufgeteilt: obere (Wasser) und untere (Chloroform). Die untere Schicht (Chloroform) wurde gewonnen, getrocknet und zur Analyse aufbewahrt. Die derivatisierten Proben wurden dann mit GC-FID-MS35,42 analysiert.

Die gereinigten IMOs (10 mg) wurden in 0,5 ml D2O gelöst. Zur Erzeugung von 1H-NMR-Spektren wurde ein 600-MHz-NMR-Spektrometer verwendet. Jedes 2D-NMR-Spektrum wurde mit Standard-Bruker-Pulstechniken aufgezeichnet. Zur Messung chemischer Veränderungen wurde der interne Acetonstandard verwendet41,42.

Alle Experimente wurden dreifach wiederholt und mit dem Varianzanalysetest (ANOVA) unter Verwendung von Graph Pad 6.0 und Prism 543 analysiert. Die Ergebnisse der statistischen Analyse wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Unterschiede zwischen den Mittelwerten der gemessenen Eigenschaften wurden mithilfe des Mehrbereichs-Tukey-Tests verglichen. In allen Fällen war ein p-Wert von weniger als 0,05 statistisch signifikant44.

In der vorliegenden Studie wurde Stärke aus Kartoffelschalen für die IMO-Produktion verwendet. Stärke wurde aus feuchten Kartoffelschalen mit einer Ausbeute von 6,5 % (± 1,1) isoliert. IMOs wurden über drei enzymatische Wege hergestellt: Verflüssigung, Verzuckerung und Transglucosylierung. Im ersten Schritt wurde die optimale Bedingung für eine nahezu vollständige Verflüssigung von Kartoffelstärke als Zeit: 1 Stunde, Temperatur: 95 °C, pH: 6,9 und Enzym (Termamyl®) zu Substratverhältnis: 0,7 U g-1 bestimmt. Der Abschluss der Verflüssigung wurde durch die Farbverteilung des Stärke-Jod-Komplexes während der Reaktion erkannt. Darüber hinaus wurde im zweiten Schritt Fungamyl® zur Verzuckerung eingesetzt. Die optimalen Bedingungen für die vollständige Verzuckerung von verflüssigter Stärke wurden als Zeit: 4 Stunden, Temperatur: 50 °C, pH: 6–6,5 und Enzym-Substrat-Verhältnis: 1,2 U g-1 bestimmt. Die HPAEC-PAD-Analyse des verzuckerten Produkts zeigte das Vorhandensein von Maltose (72 g l-1) und Maltotriose (18 g l-1) als Hauptbestandteile zusammen mit einer kleinen Menge Glucose (13 g l-1). Die ausführliche Erläuterung finden Sie in den Zusatzdaten (Ergänzungsabbildung S1). Es wurde festgestellt, dass die optimierten Bedingungen der Verflüssigung und Verzuckerung ähnlich sind, wie in früheren Studien berichtet6,16.

Das Gen (α-Transglucosidase) aus A. niger wurde in den pET-28a-Vektor (GenScript Biotech Corporation) kloniert und weiter überexprimiert. Die gereinigte α-Transglucosidase wurde auf SDS-PAGE analysiert, was ein Molekulargewicht von etwa 110 kDa anzeigte. Das Anzeigebild von SDS-PAGE (Abb. 1), ausgeschnitten aus dem Originalbild, das in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt ist. In einer früheren Studie wurde das für α-Transglucosidase kodierende Gen aus A. niger kloniert und in Pichia pastoris exprimiert, um α-Transglucosidase zu produzieren45. Allerdings wurde es in der aktuellen Studie erstmals in E. coli geklont und produziert.

10 % SDS-PAGE-Analyse zur Abschätzung des Molekulargewichts der produzierten α-Transglucosidase. (Spur 1 gereinigte α-Transglucosidase; Spur 2 Rohenzym (0,2 IPTG); Spur 3 Proteinmarker). Das SDS-PAGE-Anzeigebild wurde aus dem in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellten Originalbild zugeschnitten.

CD-Spektren von freier und immobilisierter α-Transglucosidase wurden untersucht, um den Einfluss der Immobilisierung auf die Sekundärstruktur des Enzyms zu analysieren. Insgesamt gibt es keine Veränderungen in den Sekundärstrukturen der freien und immobilisierten α-Transglucosidase (Abb. 2a), was darauf hindeutet, dass die aktuelle Immobilisierungstechnik die Struktur der α-Transglucosidase nicht beeinträchtigt, was auch mit der vorherigen Studie übereinstimmt34.

Sekundär- und Tertiäranalyse (a). CD-Spektrum immobilisierter magnetischer Nanopartikel (MNPs) mit α-Transglucosidase und freier α-Transglucosidase; (B). Das tertiäre Strukturmodell der α-Transglucosidase wurde in Phyre 2 erstellt und in der PyMOL-Software verarbeitet. Zur Identifizierung kritischer Reste wurde es einer α-Transglucosylase (Proteindatenbank-ID: 4B9Z) überlagert; (C). Die Kristallstruktur der α-Transglucosylase (4B9Z) deutete darauf hin, dass die Substratbindungstasche der α-Transglucosidase aus einer schmalen Furche mit den Resten D371, I410, W488, H718, R644, W657 und D660 besteht.

Die Tertiärstruktur der α-Transglucosidase (4B9Z) ließ darauf schließen, dass die Substratbindungstasche der α-Transglucosidase aus einer schmalen Furche mit den Resten D371, I410, W488, H718, R644, W657 und D660 besteht (Abb. 2b und c). In der aktuellen Studie fungieren D371 und D660 wahrscheinlich als nukleophile Angreifer und Säure-Base-Reste der α-Transglucosidase. Diese wurden durch Überlagerung einer Kristallstruktur der α-Transglucosylase (4B9Z) mit einem Modell der α-Transglucosylase aufgedeckt, deren D412 und D480 als nukleophiler Angreifer bzw. als Säure-Base-Rest fungieren. Das Asp660 katalysiert wahrscheinlich Maltooligosaccharid, indem es α-(1,4)-glykosidische Bindungen aufbricht und Glucose auf Maltose oder Glucose überträgt.

Um die optimale Transglucosylierungsreaktion für die Produktion von IMOs zu bestimmen, wurde der Einfluss von vier Variablen untersucht: Enzym-Substrat-Verhältnis, Temperatur, pH-Wert und Zeit. Die experimentellen Einzelfaktordaten zeigten, dass die höchste Ausbeute an IMOs (58 g l-1) mit Glucose und Maltose als anderen Bestandteilen durch HPAEC-PAD-Daten (ergänzende Abbildung S3) unter optimalen Bedingungen wie Enzym-zu- Substratverhältnis: 5,6 U g-1, Temperatur: 45 °C, pH: 5,5 und Zeit 6 h1,2,3,4,5,6.

Das Box-Behnken-Versuchsdesign wurde verwendet, um optimale Bedingungen zu untersuchen, um den höchsten IMO-Ertrag zu erzielen. Die Beziehung zwischen den unabhängigen und abhängigen Variablen kann durch die Ausbeute ausgedrückt werden: Y(IMOs) = 70,00–5,29A + 5,24,1B D-1,18 CD-5,76A2-2,23B2 + 0,72 C2-1,33D2. Die Ertragsdaten der IMO sind in Tabelle 1 aufgeführt. ANOVA wurde verwendet, um die Hinlänglichkeit und Eignung der Auswirkungen unabhängiger Faktoren auf den Ertrag zu bestimmen (ergänzende Tabelle S1). Das vorgeschlagene Modell hatte einen niedrigen P-Wert (0,0001), was auf ein hochsignifikantes Modell hinweist. Das angepasste R2 der Bestimmung, das 0,9742 betrug, deutete ebenfalls darauf hin, dass dieses Modell hochsignifikant war. Das Ergebnis zeigte, dass der IMO-Ertrag durch alle unabhängigen (A, B, C) und quadratischen Faktoren (A2, B2, C2) erheblich beeinflusst wurde35. Die Reaktionsflächendiagramme in Abb. 3 zeigten die Auswirkungen unabhängiger Variablen und wie sie miteinander auf den Ertrag von IMOs interagierten. Nach der Transglucosylierung wurden die Produkte mittels HPAEC-PAD analysiert. Das HPAEC-PAD schätzte die höchste Ausbeute an IMOs auf 70 g l-1 (± 2,1) unter den vom RSM-Modell entwickelten Bedingungen, die ein Enzym-Substrat-Verhältnis von 6,9 U g-1, eine Reaktionszeit von 9 Stunden und eine Temperatur von 45 °C aufwiesen und pH 5,5.

Konturdiagramme für die Auswirkung variabler Parameter auf die Ausbeute an IMOs, A. Reaktionszeit und Enzym/Substrat-Verhältnis, B. Temperatur und Enzym/Substrat-Verhältnis, C. pH-Wert und Enzym/Substrat-Verhältnis, D. Temperatur und Reaktionszeit, E . pH-Wert und Reaktionszeit, F. pH-Wert und Temperatur.

MNPs wurden zur Immobilisierung der α-Transglucosidase verwendet. FeCl2- und FeCl3-Salze wurden in NaOH-Lösung gemeinsam ausgefällt, um MNPs herzustellen. Anschließend wurden die MNPs mit 10 % TEOS (Tetraethylorthosilikat) beschichtet, über 16-PHDA funktionalisiert und mit α-Transglucosidase mit hoher Bindungseffizienz (82 %) immobilisiert24.

Die Daten der FT-IR-Spektroskopieanalyse (Abb. 4) bestätigten die Bildung von MNPs und die Oberflächenmodifikationen. Die funktionelle Gruppe FeT-O-FeO wurde in MNPs bei etwa 600–550 cm−1 beobachtet. Aufgrund der Si-O-Si-Bindung zeigte sich ein Streckungspeak bei etwa 1031,01–1080 cm−1, was die Siliciumdioxidbeschichtung mit Magnetit-Nanopartikeln bestätigte. Der Streckungspeak lag bei etwa 1100–900 cm−1 und bestätigte die P-O- und P-O-Fe-Gruppen nach der 16-PHDA-Verknüpfung. Das Spektralsignal bei 1643,32 cm−1 bestätigte das Vorhandensein der Amidcarbonylgruppe (NH-CO) der immobilisierten α-Transglucosidase während der Immobilisierung. Die FTIR-Ergebnisse stimmten auch mit der zuvor veröffentlichten Studie überein24.

FTIR-Spektren von auf MNPs immobilisierter α-Transglucosidase. (A). Fe3O4; (B). Fe3O4@SiO2; (C). Fe3O4@SiO2-16-PHDA; (D). Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-Transglucosidase.

Die Größenverteilung und die TEM-Bilder der Fe3O4-, Fe3O4@SiO2-, Fe3O4@SiO2-16 PHDA- und Fe3O4@SiO2-16 PHDA-α-Transglucosidase stützen alle die quasi-kugelförmige Form der Nanopartikel, wie in Abb. 5 dargestellt Der vorhergesagte Durchmesser unbeschichteter Fe3O4-Nanopartikel beträgt etwa 20 nm und steigt nach der Silica-Beschichtung weiter auf 35 nm an, wie in Abb. 5 dargestellt. Laut TEM-Daten ändern sich Nanopartikel, die mit einem Linker und einem Enzym modifiziert wurden, kaum bis gar nicht im Durchmesser , was auch mit früheren Studien übereinstimmt26. Dies könnte an ihrer geringeren Elektronendichte liegen, da organische Moleküle nur eine unzureichende TEM-Disparität aufweisen.

TEM-Bild von (a). Fe3O4, (b). Fe3O4@SiO2 (c). Fe3O4@SiO2-16-PHDA; (D). Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-Transglucosidase (Maßstabsbalken 50 nm).

Mithilfe der Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie wurden die Oberflächenmorphologie und die Partikelgröße/-form untersucht. Die Ergebnisse zeigen in Abb. 6a, dass die durchschnittliche Größe der kugelförmigen Fe3O4-Partikel 20–25 nm betrug. Darüber hinaus nahm die Kugelgröße der Fe3O4-Partikel nach der Silikatbeschichtung auf der Oberfläche der Fe3O4-Partikel leicht um etwa 34–38 nm zu (Abb. 6b), vergleichbar mit früheren Untersuchungen26, 46, 47. Nach der Modifikation mit 16-PHDA und dem Enzym α-Trasglucosidase kam es zu keiner signifikanten Veränderung des physikalischen Erscheinungsbilds der Nanopartikel.

FESEM-Bild von (a); Fe3O4 (b). Fe3O4@SiO2; EDX-Bild von (c). Fe3O4 und (d). Fe3O4@SiO2.

Die Ergebnisse der energiedispersiven Röntgenspektroskopie (EDX) wurden verwendet, um die Massenprozentzusammensetzung der synthetisierten Fe3O4- und Fe3O4/SiO2-Partikel zu charakterisieren. Abbildung 6c zeigte, dass Fe3O4 eine Massenprozentzusammensetzung von 64,8 % Fe, 31,4 % O und 3,9 % C hatte. Nach der Silica-Beschichtung betrug die atomare Zusammensetzung der Nanokügelchen 63,0 % Fe, 23,6 % O, 8,9 % C und 3,7 % Si. wie in Abb. 6d dargestellt. Die Gesamtergebnisse stimmten mit früheren Studien überein46.

Eine Röntgenbeugungsspektroskopie (XRD)-Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit und Kristallinität von Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Organophosphor-Linker und enzymmodifizierten Nanopartikeln zu bestätigen. Abbildung 7 zeigt die Diffraktogramm-Peaks der Magnetit-Nanopartikel bei 2θ = 30,2°, 35,6°, 43,2°, 57,3° und 62,9°, die (220), (311), (400), (422), (511) und (440) zugeordnet werden. Reflexionen, die die akzeptable Kristallinität von Nanopartikeln belegen, die mit zuvor veröffentlichten Daten vergleichbar ist26,36. Das Gesamtergebnis deutete darauf hin, dass MNPs die Kristallstruktur nach der Enzymimmobilisierung nicht veränderten.

XRD-Spektren von (a). Fe3O4 (b). Fe3O4@SiO2 (c). Fe3O4@SiO2-16-PHDA.

Eine TGA-Analyse wurde durchgeführt, um den prozentualen Gewichtsverlust von Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16 PHDA und Fe3O4@SiO2-16 PHDA-α-Transglucosidase zu bestimmen (Abb. 8). Die Proben wurden auf einen Bereich von 25–800 °C erhitzt, um den prozentualen Gewichtsverlust zu analysieren. Bei Temperaturen unter 200 °C zeigten alle Proben einen geringen anfänglichen Massenverlust aufgrund der Desorption von adsorbiertem Wasser. Bei einem Temperaturanstieg über 200–500 °C wurde bei Fe3O4-Nanopartikeln kein Gewichtsverlust beobachtet. Allerdings wurden bei Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16-PHDA bzw. Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-Transglucosidase Gewichtsverluste von etwa 3,2 %, 8,8 % bzw. 12,0 % verzeichnet, die ebenfalls im Einklang mit standen zuvor veröffentlichte Daten36. Der zusätzliche Verlust von rund 3,2 % bestätigte die erfolgreiche Bindung von α-Transglucosidase an MNPs.

Thermogravimetrische Analyse (TGA) von (a). Fe3O4 (b). Fe3O4@SiO2 (c). Fe3O4@SiO2-16-PHDA (d). α-Transglucosidase gebundenes Fe3O4@SiO2-16-PHDA.

Das Zeta-Potenzial wurde verwendet, um zu beurteilen, wie sich die Oberflächenladung des Enzyms und der MNPs in der Lösung auf die Stabilität seiner kolloidalen Partikel auswirkt. Die Stabilität der kolloidalen Lösung würde mit zunehmendem Zetapotential zunehmen. Die Ergebnisse der Messung des Zetapotentials von Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-16-PHDA und Fe3O4@SiO2-16-PHDA-α-Transglucosidase sind in Tabelle 2 dargestellt. Das Zetapotential von Fe3O4@SiO2-16- PHDA stieg nach der Immobilisierung der α-Transglucosidase auf positive Werte (von –46,0 auf –31,0), was darauf hindeutet, dass weniger negative α-Transglucosidase die negativ geladenen MNPs neutralisierte, was ebenfalls mit der vorherigen Studie übereinstimmt24. Darüber hinaus deuteten die PDI-Werte aller MNPs im Bereich von 0,161–0,212 auf eine höhere kolloidale Stabilität hin.

Die Aktivitäten freier und immobilisierter α-Transglucosidase wurden im Temperatur- und pH-Bereich von 30–80 °C bzw. 3,5–8,5 gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die optimale Temperatur für freie α-Transglucosidase bei 45 °C lag, während sie für immobilisierte α-Transglucosidase leicht auf 55 °C angehoben wurde (Abb. 9a). Darüber hinaus kam es zu einer signifikanten Verringerung (30 % bei 80 °C) der Aktivität der freien α-Transglucosidase, während das immobilisierte Enzym bei 80 °C fast 70 % Aktivität beibehielt. Abbildung 9b zeigte, dass freie und immobilisierte α-Transglucosidase bei optimalem pH-Wert 5,5 eine nahezu ähnliche Aktivität zeigten. Allerdings wurde bei immobilisierter α-Transglucosidase im Vergleich zum freien Enzym bei pH 8,5 eine höhere Retention der Aktivität beobachtet. Das Gesamtergebnis stimmte auch mit früheren Studien überein, die darauf hindeuteten, dass die Immobilisierung magnetischer Nanopartikel die thermische Stabilität und die pH-Stabilität verbesserte37.

Stabilität von freier und immobilisierter α-Transglucosidase (a). bei unterschiedlichem Temperaturbereich 30–80 °C und (b). pH-Bereich 3,5–8,5. (C). Wiederverwendbarkeit von immobilisierter α-Transglucosidase in nachfolgenden 10 Reaktionszyklen unter optimierten Bedingungen (6,9 U g-1, 45 °C, 9 h und pH 5,5). Die Enzymaktivität im ersten Zyklus wird als 100 % angesehen. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt.

Der Vorteil von MNPs ist die einfache Entfernung aus einem Reaktionsgemisch durch die Verwendung einfacher Magnete, die magnetische Nanopartikel als eigenständige Kandidaten für andere nichtmagnetische Nanopartikel darstellen. Das in Abb. 9c dargestellte Ergebnis zeigte deutlich, dass immobilisierte α-Transglucosidase ihre Aktivität nach 5 Reaktionszyklen bis zu mehr als 60 % beibehielt. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die maximale Ausbeute an IMOs (64 g l-1 ± 2,3) mit immobilisierter α-Transglucosidase unter optimalen Bedingungen erreicht wurde: Enzym-Substrat-Verhältnis 6,9 U g-1, Reaktionszeit 9 h, Reaktionstemperatur 45 °C °C und pH 5,524.

Die Analyse der enzymkinetischen Parameter von freier und immobilisierter α-Transglucosidase wie Michaelis-Menten-Konstante (Km), Umsatzzahl (Kcat) und katalytische Effizienz (Kcat/Km) wurde mit einer GraphPad Prism-Softwareversion 543 ausgewertet Enzymparameter wurden mithilfe von Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Diagrammen berechnet. Abb. S4 zeigt die Ergebnisse der α-Transglucosidase-Kinetikstudie bei verschiedenen Maltosekonzentrationen. Das Ergebnis zeigte bis zu 300 mM Maltose, die Reaktionsgeschwindigkeit und die Maltosekonzentration korrelieren linear. Die Reaktionsgeschwindigkeit stabilisierte sich, wenn die Maltosekonzentration mehr als 300 mM betrug. Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse stützen die Ergebnisse in Abb. S4 in ihren Beobachtungen. Die Km-Werte der freien und immobilisierten Enzyme betrugen 97,85 ± 11,40 bzw. 81,08 ± 9,990. Der Best-Fit-Wert von Kcat beträgt 1107 ± 14,28 und 715,6 ± 9,528 für freie und immobilisierte Enzyme39.

Zur Analyse der Transglucosylierungsreaktionsprodukte wurden TLC und HPLC verwendet (Abb. S5). Mit zunehmender Hydrolysezeit von Spur 1 (6 h) auf Spur 5 (30 h) stieg die Glucosekonzentration und die Oligosaccharidkonzentration nahm ab, wie in Abb. S5a gezeigt. Dies liegt daran, dass Oligosaccharide im Laufe der Zeit zu Glukose abgebaut werden, wodurch die Glukosebande mit der Zeit dunkler wird und die Oligosaccharidbande verschwindet. Abb. S5b zeigt ein HPAEC-PAD-Chromatogramm der Transglucosylierungsreaktionsprodukte nach 6 Stunden Hydrolysezeit18.

Das nach der Transglucosylierung von verzuckerter Stärke erhaltene Produkt wurde durch Größenausschlusschromatographie aufgetrennt. Darüber hinaus ergab die HPAEC-PAD-Analyse, dass der Glukosegehalt in der gereinigten IMO-reichen Fraktion auf 4 g l-1 reduziert wurde (Ergänzende Daten Abb. S6). Die anderen Bestandteile in den gereinigten Fraktionen sollten wie folgt sein: Isomaltose: 37,7 g l-1, Isomaltotriose: 21,6 g l-1, Panose: 17 g l-1, Maltose: 3 g l-1 und ein weiteres Oligosaccharid: 20 g l-1. Die Reinheit der IMO-reichen Fraktion betrug fast 85 %, was fast der in der vorherigen Studie beschriebenen entspricht48.

Zur Analyse der gereinigten IMOs wurde MALDI-TOF-MS verwendet. Die Analyse zeigte das Vorhandensein der Oligosaccharide DP 2–10 (m/z 365–1337 Da), wie in Abb. 10 dargestellt, vergleichbar mit zuvor veröffentlichten Daten49. Laut m/z-Peak-Analyse war die Menge an Oligosacchariden mit einem DP > 10 jedoch sehr gering und nicht nachweisbar.

MALDI-TOF-MS-Spektroskopie der gebildeten IMOs, die nach der Behandlung von verzuckerter Stärke mit α-Transglucosidase entstehen.

Die Glykosylbindungsanalyse von IMOs zeigt, dass terminale Glucopyranosylreste (Glcp), α-(1 → 4) und α-(1 → 6) D-verknüpfte Glcp-Reste im Molverhältnis von nahezu 1,02:0,43:1,0 häufiger vorkamen kleine Menge an α-(1 → 2) und α-(1 → 3)-verknüpften Glcp-Resten im relativen Molverhältnis von nahezu 0,12 und 0,05. Die Daten der Verknüpfungsanalyse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Detaillierte Zahlen finden Sie in den Zusatzdaten (Ergänzungsabbildung S7). Die Studie zeigte außerdem, dass IMOs α-(1 → 4)- und α-(1 → 6)-verknüpfte Glcp-Reste als primäre Bindung in Isomaltose, Isomaltotriose und Panose enthalten, was mit zuvor veröffentlichten Studien vergleichbar war50.

Die gereinigten IMOs, in denen die Fraktion durch 1H-, 13C- und 2D-NMR-NMR-Spektroskopie (TOCSY und HSQC) charakterisiert wurde (ergänzende Abbildung S8).

1H-NMR-Spektroskopie zeigte das anomere Signal bei δ 5,225 (α) und δ 4,649 (β) in Anordnung mit einer reduzierenden α-(1 → 4) D Glcp-Einheit. Darüber hinaus zeigten die Gruppen anomerer Signale entlang δ 5,389–5,395 und 4,970 das Vorhandensein einer α-(1 → 4)- bzw. α-(1 → 6)-Verknüpfung. Das Bindungsverhältnis α-(1 → 6):α-(1 → 4) betrug etwa 1,0:0,67, was auf das Vorhandensein deutlich höherer α-(1 → 6)-Bindungen schließen lässt. Das Ergebnis stimmte auch mit dem Verhältnis der α-(1 → 6):α-(1 → 4)-Verknüpfung überein, das durch Glykosylverknüpfungsanalyse ermittelt wurde.

Die chemische Verschiebung von 13C wurde aus 13C- und HSQC-Messungen abgeleitet. Die Analyse ergab das Vorhandensein anomerer Signale der α-(1 → 4)- und α-(1 → 6)-Verknüpfung im Bereich von δc 100,7 bzw. 98,3. Die anomeren Signale von δc 92,6 und 96,6 deuteten auf die Reduzierung von α-(1 → 4) D-Glcp- bzw. β-(1 → 4)-Resten hin. Die anomeren Signale stimmten mit zuvor gemeldeten Ergebnissen überein11. Das anomere Signal von δH/δC bei 5,427/90,2 und 4,785/97,1 deutete auf das Vorhandensein reduzierender α-(1 → 2) D-Glcp- und β-(1 → 2) D-Glcp-Reste hin. Darüber hinaus deutete das anomere Signal bei δH/δC bei 5,233/93,2 und 4,663/96,8 auf die Reduzierung von α-(1 → 3) D-Glcp- und β-(1 → 3)-Resten hin. Die detaillierte NMR-Analyse ist in Tabelle 5 zusammengefasst.

IMOs wurden aus Kartoffelschalenstärke durch dreistufige Verflüssigung, Verzuckerung und Transglucosylierung hergestellt. Eine rekombinante α-Transglucosidase aus A. Niger wurde in E. coli hergestellt. Die α-Transglucosidase wurde zur Wiederverwendbarkeit mit MNPs immobilisiert (5 Zyklen mehr als 60 % Aktivität) und mithilfe von FT-IR-, TEM-, FESEM-, EDX-, XRD-, TGA- und DLS-Analyse charakterisiert. Der maximale IMO-Ertrag (70 g l-1) wurde durch RSM erreicht. Die detaillierte strukturelle Charakterisierung von IMOs deutete auf DP im Bereich von 2–10 mit der Anwesenheit von α- (1 → 4) und α- (1 → 6) -D-Glcp-Resten als Hauptbestandteilen hin.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Thitaram, SN et al. Isomaltooligosaccharid erhöht die Population von Bifidobacterium im Blinddarm bei jungen Masthühnern1. Geflügel. Wissenschaft. 84, 998–1003. https://doi.org/10.1093/ps/84.7.998 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, L. et al. Auswirkungen des Isomaltooligosaccharidspiegels in der Nahrung auf die Darmmikrobiota, die Immunfunktion von Sauen und die Durchfallrate ihrer Nachkommen. Vorderseite. Mikrobiol. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.588986 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, Y., Ketabi, A., Buchko, A. & Gänzle, MG Metabolismus von Isomalt-Oligosacchariden durch Lactobacillus reuteri und Bifidobakterien. Lette. Appl. Mikrobiol. 57, 108–114. https://doi.org/10.1111/lam.12076 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kondepudi, KK, Ambalam, P., Nilsson, I., Wadström, T. & Ljungh, Å. Präbiotisch-unverdauliche Oligosaccharide, Präferenz probiotischer Bifidobakterien und antimikrobielle Aktivität gegen Clostridium difficile. Anaerobier 18, 489–497. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2012.08.005 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu, Q. et al. Die Fermentationseigenschaften von Isomaltooligosacchariden werden durch menschliche fäkale Enterotypen beeinflusst. Anaerobier 48, 206–214. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2017.08.016 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cui, J. et al. Produktion, Reinigung und Analyse der Isomalto-Oligosaccharide aus der Chinesischen Kastanie (Castanea mollissima Blume) und deren präbiotische Wirkung auf die Proliferation von Lactobacillus. Lebensmittel-Bioprod. Verfahren. 106, 75–81. https://doi.org/10.1016/j.fbp.2017.08.003 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Cho, SK et al. Ein verbesserter Prozess der Isomaltooligosaccharid-Produktion in Kimchi, der die Zugabe eines Leuconostoc-Starters und von Zuckern beinhaltet. Int. J. Lebensmittelmikrobiol. 170, 61–64 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zeng, M. et al. Einfache und effiziente chemische Synthese von Gluco-Oligosacchariden (GlcOS) mit verschiedenen glykosidischen Bindungen als potenzielle Präbiotika zur Förderung des Wachstums probiotischer Bakterien. Lebensmittelres. Int. 165, 112436. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2022.112436 (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hu, Y., Winter, V. & Gänzle, M. In-vitro-Verdaulichkeit kommerzieller und experimenteller Isomalto-Oligosaccharide. Lebensmittelres. Int. 134, 109250. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2020.109250 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sorndech, W., Nakorn, KN, Tongta, S. & Blennow, A. Isomalto-Oligosaccharide: Aktuelle Erkenntnisse in der Produktionstechnologie und deren Verwendung für Lebensmittel und medizinische Anwendungen. LWT 95, 135–142. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.04.098 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Kaulpiboon, J., Rudeekulthamrong, P., Watanasatitarpa, S., Ito, K. & Pongsawasdi, P. Synthese langkettiger Isomaltooligosaccharide aus Tapiokastärke und eine In-vitro-Untersuchung ihrer präbiotischen Eigenschaften. J. Mol. Katal. B-Enzym. 120, 127–135. https://doi.org/10.1016/j.molcatb.2015.07.004 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Zhang, N. et al. Funktionelle Oligosaccharid-Fermentation im Darm: Verbesserung der Darmgesundheit und ihrer entscheidenden Faktoren – eine Übersicht. Kohlenhydrat. Polym. 284, 119043–119116. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2021.119043 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Palframan, RJ, Gibson, GR & Rastall, RA Einfluss von pH-Wert und Dosis auf das Wachstum von Darmbakterien auf präbiotische Kohlenhydrate in vitro. Anaerobier 8, 287–292. https://doi.org/10.1006/anae.2002.0434 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Himat, AS et al. Neuartige Inhaltsstoffe auf Stärkebasis für die Formulierung von Lebensmitteln mit niedrigem glykämischen Index. Bioaktives Kohlenhydrat. Dietary Fiber 26, 100275. https://doi.org/10.1016/j.bcdf.2021.100275 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Duong Hong, Q. et al. Synthese von Isomaltooligosacchariden (IMOs) aus Süßkartoffelstärke durch gleichzeitige Verzuckerung und Transglykosylierung mit Saccharomyces cerevisiae Var. diastaticus BE 134 zur Verbesserung der Reinheit von IMOs. J. Lebensmittelqualität 2021, 1987219–1987316. https://doi.org/10.1155/2021/1987219 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Basu, A., Mutturi, S. & Prapulla, SG Produktion von Isomaltooligosacchariden (IMO) durch gleichzeitige Verzuckerung und Transglucosylierung aus Stärke und nachhaltigen Quellen. Prozessbiochem. 51, 1464–1471. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2016.06.008 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Plongbunjong, V., Graidist, P., Knudsen, KEB & Wichienchot, S. Isomaltooligosaccharid, synthetisiert aus Reisstärke und seine präbiotischen Eigenschaften in vitro. Int. J. Lebensmittelwissenschaft. Technol. 52, 2589–2595. https://doi.org/10.1111/ijfs.13545 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Chockchaisawasdee, S. & Poosaran, N. Herstellung von Isomaltooligosacchariden aus Bananenmehl. J. Sci. Lebensmittel Landwirtschaft. 93, 180–186. https://doi.org/10.1002/jsfa.5747 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gómez, JA et al. Auf dem Weg zu einer Bioraffinerie zur Verarbeitung von Abfällen aus der Kochbananen-Agrarindustrie: Prozessentwicklung zur Herstellung eines Isomalto-Oligosaccharid-Sirups aus aussortierten unreifen Kochbananenfrüchten. Lebensmittel-Bioprod. Verfahren. 133, 100–118. https://doi.org/10.1016/j.fbp.2022.03.005 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Niu, D. et al. Hocheffiziente enzymatische Herstellung von Isomalto-Oligosacchariden aus Stärke mittels Enzymcocktail. Elektron. J. Biotechnologie. 26, 46–51 (2017).

Artikel Google Scholar

Goulas, AK, Fisher, DA, Grimble, GK, Grandison, AS & Rastall, RA Synthese von Isomaltooligosacchariden und Oligodextranen durch die kombinierte Verwendung von Dextransucrase und Dextranase. Enzym-Mikrob. Technol. 35, 327–338. https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2004.05.008 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Kim, Y.-M., Seo, M.-Y., Kang, H.-K., Atsuo, K. & Kim, D. Konstruktion eines Fusionsenzyms aus Dextransucrase und Dextranase: Anwendung für die einstufige Synthese von Isomalto-Oligosaccharide. Enzym-Mikrob. Technol. 44, 159–164. https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2008.10.007 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Huang, S.-X. et al. Enzymatische Synthese unverdaulicher Oligosaccharide, katalysiert durch Dextransucrase und Dextranase aus der Maltose-Akzeptorreaktion. Biochem. Biophys. Res. Komm. 523, 651–657. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.12.010 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Singh, V. et al. Funktionalisierung metallischer/bimetallischer magnetischer Nanopartikel zur Immobilisierung von α-Amylase für eine verbesserte Wiederverwendbarkeit in biokatalytischen Prozessen. Biores. Technol. 214, 528–533. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.05.002 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Kumari, A. et al. Mehrere thermostabile Enzymhydrolasen auf magnetischen Nanopartikeln: Ein durch immobilisierte Enzyme vermittelter Ansatz zur Verzuckerung durch gleichzeitige Wirkung von Xylanase, Cellulase und amylolytischer Glucanotransferase. Int. J. Biol. Makromol. 120, 1650–1658 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Singh, V. et al. Xylanase-Immobilisierung auf Magnetit- und Magnetit-Kern/Schale-Nanokompositen unter Verwendung von zwei unterschiedlich flexiblen Alkyllängen-Organophosphonaten: Linkerlänge und Schaleneffekt auf die katalytische Enzymaktivität. Int. J. Biol. Makromol. 115, 590–599 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yusuph, M., Tester, RF, Ansell, R. & Snape, CE Zusammensetzung und Eigenschaften von Stärken, die aus Knollen verschiedener Kartoffelsorten extrahiert werden, die unter den gleichen Umweltbedingungen angebaut werden. Lebensmittelchem. 82, 283–289. https://doi.org/10.1016/S0308-8146(02)00549-6 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Bergthaller, W., Witt, W. & Goldau, H.-P. Potato starch technology. Starch–Stärke 51, 235–242. https://doi.org/10.1002/(SICI)1521-379X(199907)51:7%3c235::AID-STAR235%3e3.0.CO;2-7 (1999).

3.0.CO;2-7" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-379X%28199907%2951%3A7%3C235%3A%3AAID-STAR235%3E3.0.CO%3B2-7" aria-label="Article reference 28" data-doi="10.1002/(SICI)1521-379X(199907)51:73.0.CO;2-7">Artikel CAS Google Scholar

Halick, JV & Keneaster, K. Die Verwendung eines Stärke-Jod-Blau-Tests als Qualitätsindikator für weißen gemahlenen Reis. Getreidechemie. 33, 315–319 (1956).

CAS Google Scholar

Wang, P. et al. Vergleich des Enzyms zur Hydrolyse von Rohstärke mit herkömmlichen Verflüssigungs- und Verzuckerungsenzymen bei der Verarbeitung von Trockenmais. Getreidechemie. 84, 10–14. https://doi.org/10.1094/CCHEM-84-1-0010 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Komaki, T. & Taji, N. Studien zur enzymatischen Verflüssigung und Verzuckerung von Stärke. Landwirtschaft. Biol. Chem. 32, 860–872. https://doi.org/10.1080/00021369.1968.10859147 (1968).

Artikel CAS Google Scholar

Kuhaudomlarp, S., Stevenson, CEM, Lawson, DM & Field, RA Die Struktur einer GH149 β-(1 → 3)-Glucanphosphorylase zeigt eine neue Oberflächen-Oligosaccharid-Bindungsstelle und zusätzliche Domänen, die in der Disaccharid-spezifischen GH94-Glukose fehlen -β-(1 → 3)-Glucose (Laminaribiose)-Phosphorylase. Proteine: Struktur. Funktion. Bioinform. 87, 885–892. https://doi.org/10.1002/prot.25745 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Bramucci, E., Paiardini, A., Bossa, F. & Pascarella, S. PyMod: Sequenzähnlichkeitssuchen, multiple Sequenzstruktur-Alignments und Homologiemodellierung innerhalb von PyMOL. BMC Bioinform. 13, 1–6 (2012).

Artikel Google Scholar

Zhang, L. et al. Durch Laccase immobilisierte Gerbsäure vermittelte Oberflächenmodifikation von Halloysit-Nanoröhren für einen effizienten Bisphenol-A-Abbau. RSC Adv. 9, 38935–38942 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bijalwan, V., Ali, U., Kesarwani, AK, Yadav, K. & Mazumder, K. Hydroxyzimtsäuregebundene Arabinoxylane aus Hirsekleie – Strukturmerkmale und antioxidative Aktivität. Int. J. Biol. Makromol. 88, 296–305 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sahu, A., Badhe, PS, Adivarekar, R., Ladole, MR & Pandit, AB Synthese von Glycinamiden unter Verwendung von Protease-immobilisierten magnetischen Nanopartikeln. Biotechnologie. Rep. 12, 13–25. https://doi.org/10.1016/j.btre.2016.07.002 (2016).

Artikel Google Scholar

Patel, SN et al. Entwicklung eines thermostabilen und recycelbaren magnetischen Nanobiokatalysators für die Bioverarbeitung von Obstverarbeitungsrückständen und die D-Allulose-Synthese. Biores. Technol. 247, 633–639 (2018).

Artikel Google Scholar

Hosseinipour, SL, Khiabani, MS, Hamishehkar, H. & Salehi, R. Verbesserte Stabilität und katalytische Aktivität von immobilisierter α-Amylase auf modifizierten Fe 3 O 4-Nanopartikeln für mögliche Anwendungen in der Lebensmittelindustrie. J. Nanopart. Res. 17, 1–13 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

McCleary, BV et al. Reinigung, Eigenschaften und industrielle Bedeutung von Transglucosidase aus Aspergillus niger. Kohlenhydrate. Res. 185, 147–162 (1989).

Artikel CAS Google Scholar

Richter, A. et al. Herstellung von Stärke und löslichen Zuckern aus Pflanzenmaterial zur Analyse der Kohlenstoffisotopenzusammensetzung: Ein Methodenvergleich. Schnell. Komm. Massenspektrometer: Ein Int. J. Devoted Rapid Dissem. Aktuelle Auflösung. Massenspektrometer. 23, 2476–2488 (2009).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Mazumder, K. & York, WS Strukturanalyse von Arabinoxylanen, die aus kugelgemahlener Rutenhirse-Biomasse isoliert wurden. Kohlenhydrate. Res. 345, 2183–2193. https://doi.org/10.1016/j.carres.2010.07.034 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Ali, U., Kanwar, S., Yadav, K., Basu, S. & Mazumder, K. Wirkung von Arabinoxylan- und β-Glucan-Stearinsäureester-Beschichtungen auf die Nacherntequalität von Äpfeln (Royal Delicious). Kohlenhydrate. Polym. 209, 338–349. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2019.01.002 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Motulsky, H. Prism 5 Statistics Guide, 2007. GraphPad Soft. 31, 39–42 (2007).

Google Scholar

Kanwar, S., Ali, U. & Mazumder, K. Einfluss der Zugabe von Cellulose- und Stärkefettsäureestern auf die Mikrostruktur und die physikalischen Eigenschaften von Arabinoxylanfilmen. Kohlenhydrate. Polym. 270, 118317 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, X., Wu, D., Wu, J. & Chen, J. Optimierung der Produktion von Aspergillus niger α-Glucosidase, exprimiert in Pichia pastoris. Welt J. Microbiol. Biotechnologie. 29, 533–540. https://doi.org/10.1007/s11274-012-1207-y (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rehman, GU, Ismail, A., Goh, P., Arzhandi, MR-D. & Ismail, N. Aptes und Teos modifizierten binäres, recycelbares Hybrid-Fe3O4@GO-Nanokomposit für die photokatalytische Farbstoffentfernung. Jurnal Teknologi 80 (2018).

Zeynizadeh, B. & Gilanizadeh, M. Green und hocheffizienter Ansatz für die reduktive Kupplung von Nitroarenen an Azoxyarene unter Verwendung des neuen mesoporösen Fe 3 O 4@ SiO 2@ Co–Zr–Sb-Katalysators. Res. Chem. Intermediär. 46, 2969–2984 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Rengarajan, S. & Palanivel, R. Produktion hochreiner präbiotischer Isomalto-Oligosaccharide durch zellassoziierte Transglucosidase des isolierten Stamms Debaryomyces hansenii SCY204 und selektive Fermentation durch Saccharomyces cerevisiae SYI065. Prozessbiochem. 98, 93–105 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Sorndech, W. Isomaltooligosaccharide als Präbiotika und ihre gesundheitlichen Vorteile. Probiotika, Präbiotika und Synbiotika: Technologische Fortschritte in Richtung Sicherheit und industrielle Anwendungen, 361–377 (2022).

Ota, M., Okamoto, T., Hoshino, W. & Wakabayashi, H. Wirkung von α-d-Glucosidase aus Aspergillus niger gegenüber Dextrin und Stärke. Kohlenhydrate. Polym. 78, 287–291. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2009.03.047 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Die Autoren danken dem NABI-Geschäftsführer für seine Ermutigung und Unterstützung. Die Autoren danken dem National Agri-Food Biotechnology Institute (NABI) und der University Grants Commission (UGC) für ihre finanzielle Unterstützung. Für die NMR-Experimente danken die Autoren der NMR-Forschungseinrichtung IISER Mohali. Wir danken Dr. Kanti Kiran Kondepudi für seine Hilfe bei der Forschungsarbeit und die technische Unterstützung von Atul Kesarwani. Wir danken Raminder Kaur auch für die technische Unterstützung bei der Aufnahme von CD-Spektren.

National Agri-Food Biotechnology Institute (NABI), Sektor 81 (Knowledge City), SAS Nagar, Mohali, Punjab, 140306, Indien

Rohit Maurya, Usman Ali, Sunaina Kaul, Ravindra Pal Singh und Koushik Mazumder

Regionales Zentrum für Biotechnologie, Faridabad-Gurgaon, Haryana, 121001, Indien

Rohit Maurya

Abteilung für industrielle Biotechnologie, Gujarat Biotechnology University, North Gate Gujarat International Finance Tech-City, Gandhinagar, Gujarat, 382355, Indien

Raja Bhaiyya und Ravindra Pal Singh

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Autorenbeiträge Rohit Maurya hat beigetragen (Extraktion von Stärke; Enzymproduktion, Reinigung, Immobilisierung und Charakterisierung; IMOs-Produktion, RSM-Optimierung, Reinigung und Charakterisierung): Untersuchung; Methodik; formale Analyse; Originalentwurf schreiben. Usman Ali hat beigetragen (RSM-Optimierung von IMOs): Untersuchung; Methodik; formale Analyse. Sunaina Kaul hat beigetragen (Enzymimmobilisierung): Untersuchung; Methodik; formale Analyse. Raja Bhaiyya trug bei (Enzymproduktion): Untersuchung; Methodik; formale Analyse. Ravindra Pal Singh: Aufsicht; Methodik; Schreiben-Rezension und Bearbeitung. Koushik Mazumder: Konzeptualisierung; Aufsicht; Projektverwaltung; Methodik; schriftlicher Originalentwurf; Schreiben-Rezension und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Koushik Mazumder.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Maurya, R., Ali, U., Kaul, S. et al. Immobilisierung von α-Transglucosidase auf Silica-beschichteten magnetischen Nanopartikeln und ihre Anwendung zur Herstellung von Isomaltooligosaccharid aus der Kartoffelschale. Sci Rep 13, 12708 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38266-8

Zitat herunterladen

Eingegangen: 02. Mai 2023

Angenommen: 05. Juli 2023

Veröffentlicht: 05. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38266-8

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.